熒光定量PCR常見問題及解答
一、無 Ct 值（信號）出現(xiàn)：
1.反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠：一般都要在 35 個循環(huán)以上，可根據(jù)實驗情況增加循環(huán)，但高于45個循環(huán)會增加過多的背景信號；
2.檢測熒光信號的步驟有誤：一般采用 72℃延伸時采集熒光，Taqman 方法則一般在退火結(jié)束或延伸結(jié)束采集信號；
3.引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性；
4.探針設(shè)計不佳：設(shè)計探針溫度低于引物，造成探針未雜交上而產(chǎn)物已延伸；
5.模板量少：對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣品的zui高濃度做起；
6.模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入以及模板反復(fù)凍融的情況發(fā)生。
二、如何確認(rèn)模板中是否含有 PCR 反應(yīng)阻害物質(zhì)：
有時RNA或cDNA模板中存在對反轉(zhuǎn)錄和熒光PCR 反應(yīng)的阻害物質(zhì)。為了確認(rèn)這樣的阻害物質(zhì)的有無，我們可以使用高濃度的模板按 3－4 個梯度稀釋，并使用其進(jìn)行熒光定量 PCR 反應(yīng)。如果無阻害物質(zhì)存在，得到的 Ct 值就會依模板濃度的變化而變化；而如果模板中有阻害物質(zhì)的存在，實驗過程中我們就會發(fā)現(xiàn)高濃度的模板有反應(yīng)性能下降的現(xiàn)象。
三、Ct值出現(xiàn)過晚：
1.反應(yīng)條件不佳：未*反應(yīng)條件，可重新設(shè)計引物或探針，適當(dāng)降低退火溫度，增加鎂離子濃度等；
2.PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量不夠；
3.擴(kuò)增產(chǎn)物片段過長：一般采用 100－200bp 的擴(kuò)增長度。
四、標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系不佳：
1.加樣存在誤差，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋不呈梯度；
2.標(biāo)準(zhǔn)品降解：標(biāo)準(zhǔn)品盡量避免反復(fù)凍融；
3.引物或探針不佳：重新設(shè)計；
4.模板中存在抑制物，或模板濃度過高。
五、陰性對照液出現(xiàn)明顯的擴(kuò)增：
1.熒光 PCR mix 或水被污染；
2.引物二聚體的出現(xiàn)：在 35 循環(huán)后陰性對照出現(xiàn)擴(kuò)增屬正常情況，可配合溶解曲線進(jìn)行分析；
3.反應(yīng)過程中探針降解：用PAGE電泳對探針進(jìn)行檢測。
六、溶解曲線不止一個主峰：
1.引物設(shè)計不佳：避免二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)；
2.引物濃度不佳：適當(dāng)調(diào)整引物濃度；
3.退火溫度低：提高退火溫度；
4.鎂離子濃度過高：適當(dāng)降低鎂離子濃度；
5.模板中有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組 DNA 的污染，或通過引物設(shè)計避免非特異擴(kuò)增。
七、如何避免熒光定量PCR中基因組DNA擴(kuò)增：
1.引物設(shè)計時避免基因組DNA擴(kuò)增；
2.在RNA提取過程中使用DNaseⅠ處理去除RNA中混有的基因組DNA。
熒光定量PCR常見問題及解答
八、擴(kuò)增效率低：
1.反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解；
2.反應(yīng)條件不佳：適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法；
3.反應(yīng)體系中有抑制物：一般為模板中引入，應(yīng)先把模板適當(dāng)稀釋，再加入到體系中，減少抑制物的影響。
九、重復(fù)性不好：
1.加樣不準(zhǔn)確；
2.儀器在樣品上溫度條件有差異，溫度均一性不好；
3.模板濃度低：樣品初始濃度越低，重復(fù)性越差，應(yīng)減少樣品的稀釋倍數(shù)。
十、擴(kuò)增曲線不正常，剛進(jìn)入指數(shù)期就很快進(jìn)入平臺期并向右下彎曲：
1.基線等設(shè)置不當(dāng)：按儀器說明書重新操作；
2.模板量過多：當(dāng)擴(kuò)增曲線在10個循環(huán)內(nèi)起峰時，應(yīng)將模板稀釋100－1000倍后使用。
十一、各孔間的熒光信號如何進(jìn)行校正：
由于加樣操作的誤差、離心管透光性能的差異、熒光激發(fā)效率的差異等偶然誤差不可避免，因此儀器收集到的原始信號必須進(jìn)行歸一化校正，以消除這些因素對定量結(jié)果的影響。這種校正可以通過在反應(yīng)體系中添加額外的熒光染料來實現(xiàn)，一般采用紅色ROX熒光，稱為陽性參比信號。ROX在反應(yīng)緩沖液中的濃度是固定的，因此其信號的強(qiáng)度與反應(yīng)體系的總體積和總的熒光激發(fā)效率正相關(guān)。ROX校正可以提高定量數(shù)據(jù)的精度和重現(xiàn)性，減少孔間差異。
十二、熒光定量PCRCT值一般在多少后認(rèn)為模板沒擴(kuò)增：
當(dāng)進(jìn)入對數(shù)期的循環(huán)數(shù)大于35時，Real Time RT-PCR檢測無效，基因沒有表達(dá)；當(dāng)進(jìn)入對數(shù)的循環(huán)數(shù)在 32-35 個循環(huán)時，需要有至少 3 個重復(fù)才能判斷是否能檢測到基因的表達(dá)。
