生物試劑告訴您如何提取高質(zhì)量RNA
1.迅速滅活內(nèi)源的RNA酶，以防止RNA降解。
以下3個(gè)方法均可有效使內(nèi)源RNA酶失活：
1）用含離液（如胍鹽）的細(xì)胞裂解液收獲樣品，并立即勻漿。
2）用液氮瞬間凍結(jié)樣品。值得特別注意的是：組織塊必須保證足夠小，在浸入液氮的瞬間就能凍結(jié)，以確保瞬間令RNA酶失活。
3）立即將樣品置于RNAfixer無液氮RNA樣品儲(chǔ)存液中。它是一種水相、無毒的收集試劑，能立即穩(wěn)定并保護(hù)完整、未凍結(jié)的組織和細(xì)胞樣品中的RNA。關(guān)鍵要點(diǎn)是組織樣品切片一定要夠?。?lt;0.5 cm），這樣RNAfixer才能在RNase破壞RNA之前迅速滲入組織塊中。
2.使用正確的細(xì)胞或組織儲(chǔ)存條件
在樣品用液氮瞬間凍結(jié)之后，應(yīng)該儲(chǔ)存在-80°C，千萬不能解凍。即使是置于含有胍鹽的裂解液中作勻漿前的短暫解凍，也會(huì)導(dǎo)致RNA的降解和損失。瞬間凍結(jié)的組織應(yīng)該首先在超低溫條件下先研磨成粉，然后置于裂解液中進(jìn)行勻漿。
RNAfixer使樣品儲(chǔ)存更為便利。儲(chǔ)存在RNAfixer中的細(xì)胞或組織可在室溫下穩(wěn)定保存長達(dá)1個(gè)星期，在4°C可穩(wěn)定保存長達(dá)1個(gè)月，或*保存在-20°C。
3. 破壁方法
細(xì)胞或組織的*勻漿對RNA提取來說，是一個(gè)很關(guān)鍵的步驟，它能夠防止RNA的損失和降解。勻漿的方法應(yīng)根據(jù)細(xì)胞或組織的類型來選擇。大部分培養(yǎng)的細(xì)胞可以置于細(xì)胞裂解液中，通過簡單的渦旋震蕩來勻漿；而動(dòng)物組織、植物組織、酵母和細(xì)菌、真菌則常常需要更加劇烈的方法，通常用液氮研磨。比如說細(xì)菌（特別是革蘭氏陽性菌）的細(xì)胞壁，就需要溶菌酶消化來實(shí)現(xiàn)*的細(xì)胞裂解和RNA的zui大回收。酵母和革蘭氏陽性菌通常還需要液氮研磨過程中加入玻璃微珠幫助破壁，酵母提取也可以加入諸如Lyticase等破壁酶幫助破壁，再用TRIpure或RNApure進(jìn)行提取。
4. 選擇的RNA分離方法
現(xiàn)有眾多的RNA分離方法也許令人難以取舍。目前zui簡單也是zui安全的方法是柱式分離，如RNApure 因?yàn)椴僮骱唵?，時(shí)間短，純度高而受到大家的喜愛，RNApure不需要DNA酶消化DNA，節(jié)省了時(shí)間，避免RNA的降解，從而提高了產(chǎn)量；相對非柱式分離（如TRIZOL），去除蛋白及其他雜質(zhì)干凈，提高了純度，對于細(xì)胞、組織、一般植物均非常適合。植物RNA的提取比較難抉擇，植物RNA提取受酚、多糖、蛋白雜質(zhì)、次生代謝物含量的影響，一般用TRIZOL提取純度不高，而且很多植物用TRIZOL提取不出來。這時(shí)候可以選擇多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（水仙、辣椒、胡蘿卜、玉米、百合、小麥、西紅柿、花菜、油菜等）和通用植物RNA提取試劑盒（適合絕大多數(shù)植物提取，包括：蘋果、葡萄、草莓、香蕉、龍眼、荔枝、草坪植物、松樹、杉樹、白樺、紫松果、彩葉草、一品紅、夾竹桃、垂葉榕、紫羅蘭、月季、天竺藍(lán)、牽?；ǖ龋环浅Ｖ档靡惶岬氖茄海òㄑ?、血漿、腦脊液、其他液體）RNA的提取用TRIZOL和紅細(xì)胞裂解的方法效果都不好，紅細(xì)胞裂解液不含有RNA酶的抑制成分，這個(gè)過程RNA很容易降解，推薦使用TRIpure LS 或者血液總RNA提取試劑盒。
5.消除環(huán)境RNase的污染
為了得到完整的、高品質(zhì)RNA，在整個(gè)RNA制備過程中，當(dāng)RNA離開強(qiáng)蛋白變性劑（如離液裂解液或酚）的保護(hù)時(shí)，避免引入新的RNase污染就非常關(guān)鍵。由于RNase幾乎是*，所以必須確保與純化的RNA接觸的每一樣?xùn)|西都是無RNase污染的。所有的表面，包括移液器、工作臺(tái)、玻璃器皿和制膠設(shè)備，都必須用表面去污凈化溶液如RNase噴霧清除劑 來處理過，去除各種溶液或者反應(yīng)緩沖液中可能存在的RNase污染，可以用RNAsafe。必須保證一直使用無RNase的槍頭、試管和溶液，手套也應(yīng)經(jīng)常更換。
6.低濃度RNA的沉淀
純化得到的RNA可能需要通過沉淀來濃縮，以滿足一些下游應(yīng)用的需要。醋酸銨（NH4OAc） 沉淀（加0.1體積的5 M 醋酸銨、2-2.5體積的無水乙醇，-20°C放置25分鐘以上）可以很好地回收RNA。如果需要定量回收低濃度的RNA（ng/ml），可以采用共沉淀（如linear acrylamide糖原glycogen,、酵母yeast RNA ）的方法。核酸助沉劑是linear acrylamide，當(dāng)RNA用于RT-PCR分析時(shí)，線性的丙烯酰胺和DNase處理的糖原都可以作為理想的共沉淀劑，因?yàn)樗鼈兌疾缓珼NA污染，糖原含量高會(huì)抑制PCR反應(yīng)。酵母RNA和未處理的糖原會(huì)給樣品帶來核酸污染，有可能影響RT-PCR的結(jié)果。沉淀后，注意避免RNA沉淀過分干燥，因?yàn)檫@可能導(dǎo)致很難重新溶解。
7.提取好的RNA如何儲(chǔ)存
如果只是短期儲(chǔ)存，重懸的RNA應(yīng)放置于-20°C；如果是長期儲(chǔ)存的話，就應(yīng)該放置于-80°C。盡管重懸于水或緩沖液中的RNA也可以儲(chǔ)存在-80°C，但保存RNAlong中的RNA沉淀則更加穩(wěn)定，可以長期保存。我們推薦將RNA溶液分裝在幾支管中。這會(huì)避免反復(fù)凍融損傷RNA，并預(yù)防偶然的RNase污染。
員_a.png)