研生試劑-酶抑制法快速檢測農(nóng)藥殘留
鑒于常規(guī)檢測所需儀器設(shè)備昂貴且龐大、笨重，需要熟練專業(yè)技術(shù)人員操作，只能在實驗室內(nèi)進行抽樣檢測，難以滿足樣品現(xiàn)場快速檢測的要求，各國科技工作者還應(yīng)用新原理、新技術(shù)試圖研究開發(fā)出一系列特異性強、靈敏度高、方便快捷、準(zhǔn)確安全、簡單廉價的快速檢測新方法。本研究重點概述國內(nèi)外近期關(guān)于酶抑制法、免疫分析法和生物傳感器在農(nóng)藥殘留快速檢測技術(shù)中的研究和應(yīng)用狀況，并展望了酶抑制法、免疫分析法和生物傳感器在農(nóng)藥殘留快速檢測應(yīng)用中的未來發(fā)展趨勢。
酶抑制法是利用有機磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥可特異性地抑制昆蟲中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿酯酶(AChE)的活性，造成神經(jīng)傳導(dǎo)介質(zhì)乙酰膽堿的積累，影響正常傳導(dǎo)，使昆蟲中毒致死這一毒理學(xué)原理，將AChE與樣品反應(yīng)，如果樣品中沒有農(nóng)藥殘留或者殘留量極少，AChE的活性就不被抑制，反之，如果農(nóng)藥殘留量比較高，AChE的活性就會被農(nóng)藥所抑制。在酶反應(yīng)試驗中加入底物和顯色劑觀察顏色的變化或測定某種特定化合物反應(yīng)的物理化學(xué)信號的變化，可判斷是否存在有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留。目前，依據(jù)酶抑制法原理設(shè)計的農(nóng)藥殘留檢測方法主要有速測卡法（紙片法）、比色法（分光光度法）和膽堿酯酶生物傳感器。
1.1速測卡法（紙片法）
將膽堿酯酶(ChE)和乙酰膽堿類似物靛酚乙酸酯分別經(jīng)固化處理后加載到濾紙片上。靛酚乙酸酯在ChE催化下迅速發(fā)生水解反應(yīng)，生成乙酸和靛酚（藍色）。如果ChE與機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥結(jié)合，便失去催化靛酚乙酸酯水解的能力。因此，在樣品中只要有微量有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥存在，就能強烈地抑制藍色靛酚的生成，靠目測就可判斷農(nóng)藥殘留情況：藍色（即空白對照卡顏色）或天藍色（陰性），淺藍色或白色（陽性）。衛(wèi)生部食品衛(wèi)生監(jiān)督檢驗所等7家單位的實驗與驗證數(shù)據(jù)的統(tǒng)計結(jié)果表明，速測卡法（紙片法）對常用農(nóng)藥的檢出限為0.3~3.5 mg/kg[7]，均高出農(nóng)藥殘留*，因此在使用速測卡檢驗蔬菜樣品為陽性時，即可視為有機磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥已超標(biāo)。該方法檢出時間為15~30 min，對超出中國允許殘留量或違禁使用的有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的有效檢出率可達80%以上。該方法不需儀器，操作方便、快速，測試成本低，適用于現(xiàn)場篩選。國內(nèi)企業(yè)利用該法原理的商品化速測卡和速測儀適用于基地、農(nóng)貿(mào)市場和超市的一般性農(nóng)藥殘留現(xiàn)場檢測篩查。
1.2比色法（分光光度法）
將蔬菜、水果的農(nóng)藥殘留樣品提取液與從敏感生物 中 提 取 的ChE（GB/T 5009.199—2003推 薦 使 用AChE，NY/T 448—2001推 薦 使 用 丁 酰 膽 堿 酯 酶(BuChE)，GB/T 18630—2002推薦使用小麥酯酶）作用，以硫代乙酰膽堿(GB/T 5009.199—2003)或碘化硫代丁酰膽堿(NY/T 448—2001)或碘化硫代乙酰膽堿(GB/T 18630—2002)為底物，二硫代二硝基苯甲酸(GB/T 5009.199—2003，NY/T 448—2001)或2,6-二氯靛酚(GB/T 18630—2002)為顯色劑，經(jīng)一定時間反應(yīng)后，利用分光光度計在412 nm(GB/T 5009.199—2003)或410 nm(NY/T 448—2001)或600 nm(GB/T 18630—2002)波長下比色，根據(jù)吸光值的變化計算ChE的抑制率(GB/T 5009.199—2003，NY/T 448—2001)或直接利用吸光值(GB/T 18630—2002)，判斷有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量是否超標(biāo)[GB/T 5009.199—2003規(guī)定抑制率≥50%（陽性），NY/T 448—2001抑制率≥70%（陽性），GB/T 18630—2002吸光值＜0.7（未檢出）；0.7~0.9（可能檢出）；>0.9（檢出）]。
比 色 法(分 光 光 度 法)檢 出 限 一 般 在0.05~5.00 mg/kg，檢出時間為30 min，對超出中國允許殘留量或違禁使用的有機磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的有效檢出率可達80%以上。國內(nèi)企業(yè)按GB/T5009.199—2003或NY/T 448—2001對分光光度計進行改裝使之適合比色法檢測要求，目前，常用國產(chǎn)農(nóng)藥殘留速測儀均為多通道光路設(shè)計，可同時檢測多個樣品，直接顯示檢測結(jié)果，還可帶有數(shù)據(jù)接口，通過數(shù)據(jù)管理軟件上傳檢測數(shù)據(jù)，實現(xiàn)數(shù)據(jù)共享和網(wǎng)上傳輸，自動化程度較高，是目前各省市和縣區(qū)質(zhì)檢監(jiān)督部門日常檢測的主要速測儀器。
AChE和BuChE是酶抑制法的關(guān)鍵和核心，影響ChE的活性和穩(wěn)定性的因素很多，因此，為酶抑制法快速檢測用酶制定標(biāo)準(zhǔn)勢在必行。目前，只有*頒布了《NY/T 1157—2006農(nóng)藥殘留檢測丁酰膽堿酯酶》[9]，對BuChE的外觀、比活力、定性（包括SDS-PAGE、Km值、布比卡因抑制試驗）、穩(wěn)定性、敏感性、裝置等技術(shù)指標(biāo)進行了明確規(guī)定。而由于相應(yīng)的缺失，zui常用的AChE活性、定性、穩(wěn)定性和敏感性等指標(biāo)沒有統(tǒng)一的測試和鑒定標(biāo)準(zhǔn)，造成國
內(nèi)市場上商品AChE質(zhì)量參差不齊，嚴(yán)重影響速測結(jié)果的準(zhǔn)確性。另外，中國現(xiàn)行的3個蔬菜中有機磷及氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留量快速檢測標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布實施均達10年或10年以上。而近10年來，中國多次修訂了有關(guān)農(nóng)藥殘留*，發(fā)布的《GB 2763—2012食品安全 食品中農(nóng)藥zui大殘留*》[10]已于2013年3月1日起實施；zui近幾年，速測產(chǎn)品及其配套試劑都得到了快速發(fā)展，并且在實際應(yīng)用中積累了大量實踐經(jīng)驗，為下一步修訂和更新蔬菜中有機磷及氨
基甲酸酯農(nóng)藥殘留量快速檢測標(biāo)準(zhǔn)打下了堅實基礎(chǔ)。
