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研生試劑-細(xì)胞受體結(jié)合免疫測(cè)定CIC法

點(diǎn)擊次數(shù):610 更新時(shí)間:2014-05-28
 

                          研生試劑-細(xì)胞受體結(jié)合免疫測(cè)定CIC

 細(xì)胞受體結(jié)合免疫測(cè)定法是根據(jù)CIC可與某些細(xì)胞表面的Fc受體或補(bǔ)體受體結(jié)合而建立的細(xì)胞技術(shù),這類方法有靈敏度較高,特異性較強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),但需進(jìn)行活細(xì)胞培養(yǎng)或細(xì)胞分離,影響因素多,重復(fù)性較差,目前僅適用于實(shí)驗(yàn)研究。此類技術(shù)有多種方法。

    Raji細(xì)胞是從Burkitt淋巴瘤患者分離建株的B淋巴細(xì)胞系??稍隗w外連續(xù)傳代培養(yǎng),細(xì)胞表面沒有膜免疫球蛋白,Pc受體的親和力很低,但有C3、C3b和C3d受體及Clq受體,而且不易脫落。因此能使結(jié)合補(bǔ)體的IC吸附在細(xì)胞上,然后再于反應(yīng)系統(tǒng)中加入熒光素或i125標(biāo)記的抗人IgG抗體,使其與結(jié)合在Raji細(xì)胞上的IC中的IRC反應(yīng),計(jì)算Rail細(xì)胞上結(jié)合的IC中滲入的核素量,即可判定IC的存在與含量。

(一)試劑

    1.Raji細(xì)胞懸液  將Raji細(xì)胞培養(yǎng)在含20%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中2—3d后即可收集應(yīng)用,該細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)不貼壁、不結(jié)團(tuán),生長(zhǎng)容易(一般3d即可傳一代),培養(yǎng)條件不苛求。但pH值應(yīng)在6.5左右,超過pH7.0則生長(zhǎng)不良。收集細(xì)胞時(shí)要計(jì)數(shù)和檢查活細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)排除試驗(yàn)要求活細(xì)胞在95%以上。

    2.核素標(biāo)記抗IgC抗體  將兔抗人IgC血清經(jīng)DE52分離兔IsC,用PBS稀釋成蛋白質(zhì)1mg/mL,按每ug蛋白質(zhì)結(jié)合0.3uCi125I標(biāo)記抗人IgC抗體。

(二)操作步驟

    1.取培養(yǎng)72h的Raji細(xì)胞1 800r/rain離心10rain,棄去上清液,細(xì)胞沉淀中加入不含小牛血清的1640培養(yǎng)液,洗2次。

    2.計(jì)數(shù)Raji細(xì)胞數(shù),用*1640培養(yǎng)液配成107/mL細(xì)胞懸液。

    3.取1滴細(xì)胞懸液加等量0.1%臺(tái)盼藍(lán),放37℃10rain,鏡檢著色細(xì)胞不應(yīng)超過5%。

    4.在試管中加入細(xì)胞懸液501~L,再加入1:4稀釋的受檢血清25uL。

    5.搖勻后放37~(2 45rain,每5-10rain輕搖一次,使其充分作用。

    6.用1640培養(yǎng)液將細(xì)胞洗滌3次,1 000r/min離心5min,棄去上清液。

    7.在細(xì)胞沉淀物中加125I標(biāo)記的抗人TgG抗體,用含1%人血清白蛋白(HSA)的1640培養(yǎng)液將標(biāo)記物稀釋成7-10ug/mL。加入標(biāo)記物后置4℃30min,每間隔5—10min輕搖1次。

    8.用含1%人血清白蛋白(HSA)的1640培養(yǎng)液洗滌3次,每次1 800r/rain離心10min。

    9.取細(xì)胞沉積物用Y計(jì)數(shù)器測(cè)cpm值。

  10.用熱變性IgG40ug溶于50uL新鮮混合人血清中,然后倍比稀釋成10個(gè)稀釋度,按上述方法操作測(cè)定cpm。

(三)結(jié)果判斷

    以熱聚合IgC的含量為橫坐標(biāo),cpm為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)參考曲線。自參考曲線查出IC中IgC的ug數(shù),按ug/mL報(bào)告。

(四)注意事項(xiàng)

    1.Raji細(xì)胞有時(shí)也帶有Pc受體和表面膜免疫球蛋白,為使實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映真實(shí)情況,應(yīng)預(yù)試條件,同時(shí)在實(shí)驗(yàn)中加陰性對(duì)照。

    2.用熱變性IsC作對(duì)照和參考時(shí),一定要用新鮮血清作稀釋劑,以補(bǔ)充補(bǔ)體。

除此以外,細(xì)胞受體結(jié)合免疫測(cè)定方法中的血小板凝集試驗(yàn)亦用于實(shí)驗(yàn)研究。其原理是免疫復(fù)合物與血小板相互作用后引起血小板表面發(fā)生改變,導(dǎo)致血小板凝集(有人認(rèn)為血小板凝集與其表面Fc受體活化有關(guān))。試驗(yàn)中必須采用新鮮分離的有活力的血小板,因?yàn)樵贗C存在時(shí),血小板表面的改變有賴于其代謝狀態(tài)。除IC外,高濃度的游離免疫球蛋白與血小板表面抗原反應(yīng)的抗體和其他物質(zhì),如荷電分子、蛋白水解酶和某些粘病毒也可使血小板聚集;Clq、IgM、RF能抑制IC引起的血小板聚集;待檢血清于試驗(yàn)前加熱滅活,會(huì)使其血小板凝集滴度升高或降低。

 
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